2015年6月7日 星期日

2015 生科系實驗室博覽會海報索引





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2015年6月4日 星期四

大鼠三叉神經痛腦影像


疼痛的感覺在人體的運作非常必須：它告訴我們哪裡痛，讓我們可以避開危險，當危險結束疼痛也會散去。然而若是疼痛總是長期地沒來由地隨機出現，事情就變得不那麼輕鬆愉快。慢性痛患者長期與疼痛共處，過去研究發現慢性痛的一大成因是中樞的敏感化。本題目於是以大鼠的慢性三叉神經痛模型模擬慢性痛病患之病徵後收取功能性影像探討之。我們使用錳離子增益性磁振造影（ＭＥＭＲＩ），利用錳離子的雙重特性：（1）隨著神經元活化經鈣離子通道進入細胞並累積（2) MRI T1信號對比增強 於是乎我們能準確地觀察清醒動物在慢性痛狀態的神經活性變化。觀察大鼠在操弄前，操弄後，以及脈衝電波高頻刺激（ＰＲＦ）治療後在行為學及影像上的定量成果。（趙婉婷）


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Brainbow


Brainbow 是一門技術允許實驗者們讓腦中相鄰的神經元彼此表現出不同的顏色，藉此來追蹤或研究其形態的變化。

最早在2007年時，由哈佛大學的 Jeff W. Lichtman 和 Joshua R. Sanes 所研發出來，並將研究成果刊載在Nature上。



透過 cre-loxP recombination system，藉此讓序列上的螢光蛋白表現的比例改變，進而組合出多種顏色的變化。


圖上為當時 brainbow 基因轉殖小鼠在各個不同部位的表現情況。
( A. 耳部肌肉內的神經纖維 B. 腦幹內的軸突截面 C. 海馬迴齒狀回)

然而，因為在研究上的侷限，以及過多的顏色表現造成判讀上的困難。
因此在2013年時，Jeff W. Lichtman 和 Joshua R. Sanes 又進一步的開發出利用
adeno-associated virus (AAV) 來感染細胞，使細胞表現brainbow sequence 的方式，來改善當初的不便。



上圖解說其實驗設計。利用兩株不同的AAV，彼此攜帶不同的螢光蛋白的片段，
並一樣透過cre-loxP recombination system，藉此重組出不同的顏色表現。


而從圖中可發現，利用此兩株AAV配合recombinase 的方式，使得顏色的變化大幅下降至九種，因此提升了實驗人員的判讀準確度與方便性。

透過將這兩株AAV混合，並注射入特定組織有表現Cre 的小鼠，待一定時間讓AAV徹底感染後，便可提供一豐富的數據讓研究者們對於特定組織間的型態變化有更進一步的了解。

未來，本實驗室將利用這技術結合clarity透明方法，藉此進一步觀察肌肉與神經組織的疼痛神經網路。


Reference:
  1. Nature (2007) 450:56-62
    Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in thenervous system
  2. Nat Rev Neurosci. (2008) 9: 417–422
    A technicolour approach to the connectome
  3. Nature Methods (2013) 10: 540-547
    Improved tools for the Brainbow toolbox







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Optogenetic Approaches to Uncovering the Thalamocortical Plasticity in Neuropathic Pain



l   光遺傳學(Optogenetics)
史丹佛大學神經科學家Karl Deisseroth將一種自海藻中發現的光敏感離子通道--channelrhodopsin的DNA序列，利用遺傳學的方法(例如以病毒感染，或是利用cre-loxp recombination system)轉殖進入神經細胞中。表現channelrhodopsin的神經細胞便可以對特定波長的光線產生反應。因此，只要照射光線在神經細胞上，就可以令channelrhodopsin開啟，讓神經細胞活化產生動作電位。
光遺傳學是神經科學上的一個重大突破。這項技術可以克服傳統電刺激不能解決的問題：(1)我們可以用光刺激活化特定的神經細胞，而不會去影響到其他不相關的神經細胞。(2)有別於電刺激需要保留整個神經細胞，光刺激只需要刺激突觸末梢就可以引發動作電位和神經傳導物質釋放。

             不同種類的光敏感離子通道可以受到不同波長的光激發，並且通透
                不同的離子。(Zhang et al.,2009. Nat.Protoc.)


l   利用光遺傳學的方法研究視丘與腦島皮質神經連結的變化
在過去的研究發現，視丘中的mediodorsal thalamic nucleus (MD)、posterior triangular thalamic nucleus (PoT)分別與前端腦島、後端腦島有神經連結，而且此神經迴路可能與神經痛相關。因此我們想利用光遺傳學的方法研究這條視丘-皮質神經迴路在神經痛後是否有所改變。
我們將攜帶有channelrhodopsin DNA序列的病毒(AAV-CaMKIIα-ChR2-EYFP)打入小鼠MD或是PoT中，因此只有在此二處，以及帶有CaMKIIα啟動子的神經細胞才會表現channelrhodopsin，並且以EYFP螢光做辨識。未來將利用patch clamp技術紀錄腦島皮質的神經活性，用光刺激帶有EYFP螢光的視丘神經末端，比較神經痛對神經活性帶來的改變。


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2015年6月3日 星期三

Roles of Posterior Insular Cortex in Rat Model of Neuropathic Pain





  •  甚麼是神經痛 (Neuropathic Pain)?
神經痛是由於神經受到損傷所造成的長期疼痛。外傷、細菌病毒感染、癌症入侵都有可能發展出神經痛。這種疼痛會持續非常長的一段時間，可能數月、數年甚至是一輩子。神經痛有幾種明顯的症狀：(1)自發性疼痛(spontaneous pain)，沒有受到任何外界刺激，自己會產生疼痛 (2)觸感痛(allodynia)，正常狀況下的觸覺刺激變成了疼痛 (3)疼痛致敏化(hyperalgesia)，對痛刺激更加地敏感

  • 後端腦島皮質(posterior insular cortex, PIC)與疼痛的關係
後端腦島皮質在許多研究中都被發現與疼痛表現有關。在人類影像研究中，當接受疼痛刺激時，後端腦島皮質會有活化的情形。另外，在動物型態實驗中，後端腦島皮質與腦中其他疼痛相關腦區有神經連結，例如：前端腦島(RAIC)和導水管週圍灰質(PAG)。
但是，後端腦島皮質在神經痛當中扮演的角色是甚麼，卻很少有人去研究。因此我的研究便是探討後端腦島皮質是否也在神經痛中佔有一席之地。

  • 實驗內容
將NMDA打入大鼠的後端腦島皮質，製造神經興奮性毒性(neurotoxicity)並破壞它。比較在神經痛狀況下的大鼠，破壞後端腦島皮質與否是不是會對神經痛的症狀造成改變。
結果發現，後端腦島皮質被破壞的神經痛老鼠，機械性觸感痛(mechanical allodynia)的症狀會有些許的改善。這表示說後端腦島皮質的確參與在神經痛的症狀表現上，而且只特別針對機械性觸感痛。我們也由此推測，不同神經痛的症狀可能是由不同的大腦區域處理、表現的。

  • 參考資料
Benison, A. M., Chumachenko, S., Harrison, J. A., Maier, S. F., Falci, S. P., Watkins, L. R., & Barth,   D. S. (2011). Caudal granular insular cortex is sufficient and necessary for the long-term    
  maintenance of allodynic behavior in the rat attributable to mononeuropathy. J Neurosci, 31(17),
  6317-6328.
Segerdahl, A. R., Mezue, M., Okell, T. W., Farrar, J. T., & Tracey, I. (2015). The dorsal posterior      
  insula subserves a fundamental role in human pain. Nat Neurosci, 18(4), 499-500.




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Pain-associated nerve terminal in the gastrocnemius muscle 腓腸肌中痛覺相關神經纖維末梢之研究



  • 在本研究，我們利用老鼠腓腸肌作為目標物，來探討其中痛覺相關神經纖維末梢在周邊組織中的分布情形，作為一個基本的實驗前研究。
  • 我們採用免疫螢光染色的方式，利用抗體與抗原間專一的結合反應，並透過接上不同的螢光蛋白，來觀察目標物在特定組織中分布的情形。
    而在本研究中，我們利用不同的抗體，例如像TRPV1 (痛覺相關陽離子通道)、Neurofilament 200 (NF-200，標定尺寸中或大的神經元)，以及Peripherin (標定尺寸小或中的神經元)來當作marker，進一步來探討痛覺相關神經纖維末梢在腓腸肌中的分布情形。
  • 而在未來的工作裡，我們將進一步配合 clarity (組織透明化) 以及 brainbow (利用腺病毒來感染細胞使其表現特殊的基因片段，讓細胞帶有不同的顏色)，來進一步探討組織間的型態變化以及是否會因慢性肌肉痛而有所影響。
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2015年5月29日 星期五

行為電生理研究室

實驗室主持人
嚴震東
實驗室明名稱
行為電生理研究室
近年研究主題
老鼠前腦如何處理痛覺訊息
急性疼痛如何轉變為慢性疼痛
慢性疼痛的治療機制
疼痛同理心"感同身受"的神經機制
研究室簡介
本實驗室研究主題是疼痛的腦機制。我們希望了解疼痛強度及不舒服的訊息在腦中處理的神經網路。並且了解這些神經網路在慢性疼痛時的功能變化。

本實驗室正在進行的研究主題有：
(1)  慢性神經痛的腦部活性變化(林校群、黃郁昕、趙子豪、葉瀚元)
(2)  慢性神經痛的藥物及電刺激治療的生物機制(林校群、黃郁昕、趙婉婷)
(3)  慢性肌肉痛的電刺激治療的生物機制(李志昌、林校群、龔穎之)
(4)  癌症骨轉移引起的疼痛及止痛藥作用的生物機制(朱玟樺、林文瑛)
(5)  疼痛同理心相關的大腦皮層操作機制(吳玟誼)

本實驗室準備進行的研究主題有：
(1)  結合神經遺傳標定及CLARITY透明方法觀察肌肉及神經組織的疼痛神經網路(李志昌、紀瀚雄)
(2)  結合腦功能影像方法(calcium imaging, 功能性MRI)，光遺傳及電生理等方法研究疼痛引起的長期腦部變化(趙子豪、葉瀚元、趙婉婷)

   
                        
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