2015 生科系實驗室博覽會海報索引

• CLARITY 組織透明化 (李志昌）
• 疼痛同理心相關的大腦皮層操作機制（吳玟誼）
• MEMRI study of neuropathic pain （趙子豪）
• 大鼠三叉神經痛腦影像（趙婉婷）
• 癌症骨轉移引起的疼痛（朱玟樺）
• 神經痛的大腦功能性變化（林校群）
• Optogenetic Approaches to Uncovering the Thalamocortical Plasticity in Neuropathic Pain (葉瀚元)
• Roles of Posterior Insular Cortex in Rat Model of Neuropathic Pain （葉瀚元）
• 腓腸肌中痛覺相關神經纖維末梢之研究 （紀瀚雄）

大鼠三叉神經痛腦影像

疼痛的感覺在人體的運作非常必須：它告訴我們哪裡痛，讓我們可以避開危險，當危險結束疼痛也會散去。然而若是疼痛總是長期地沒來由地隨機出現，事情就變得不那麼輕鬆愉快。慢性痛患者長期與疼痛共處，過去研究發現慢性痛的一大成因是中樞的敏感化。本題目於是以大鼠的慢性三叉神經痛模型模擬慢性痛病患之病徵後收取功能性影像探討之。我們使用錳離子增益性磁振造影（ＭＥＭＲＩ），利用錳離子的雙重特性：（1）隨著神經元活化經鈣離子通道進入細胞並累積（2) MRI T1信號對比增強 於是乎我們能準確地觀察清醒動物在慢性痛狀態的神經活性變化。觀察大鼠在操弄前，操弄後，以及脈衝電波高頻刺激（ＰＲＦ）治療後在行為學及影像上的定量成果。（趙婉婷）

Brainbow

Brainbow 是一門技術允許實驗者們讓腦中相鄰的神經元彼此表現出不同的顏色，藉此來追蹤或研究其形態的變化。

最早在2007年時，由哈佛大學的 Jeff W. Lichtman 和 Joshua R. Sanes 所研發出來，並將研究成果刊載在Nature上。



透過 cre-loxP recombination system，藉此讓序列上的螢光蛋白表現的比例改變，進而組合出多種顏色的變化。

圖上為當時 brainbow 基因轉殖小鼠在各個不同部位的表現情況。

( A. 耳部肌肉內的神經纖維 B. 腦幹內的軸突截面 C. 海馬迴齒狀回)

然而，因為在研究上的侷限，以及過多的顏色表現造成判讀上的困難。
因此在2013年時，Jeff W. Lichtman 和 Joshua R. Sanes 又進一步的開發出利用
adeno-associated virus (AAV) 來感染細胞，使細胞表現brainbow sequence 的方式，來改善當初的不便。

上圖解說其實驗設計。利用兩株不同的AAV，彼此攜帶不同的螢光蛋白的片段，

並一樣透過cre-loxP recombination system，藉此重組出不同的顏色表現。

而從圖中可發現，利用此兩株AAV配合recombinase 的方式，使得顏色的變化大幅下降至九種，因此提升了實驗人員的判讀準確度與方便性。

透過將這兩株AAV混合，並注射入特定組織有表現Cre 的小鼠，待一定時間讓AAV徹底感染後，便可提供一豐富的數據讓研究者們對於特定組織間的型態變化有更進一步的了解。

未來，本實驗室將利用這技術結合clarity透明方法，藉此進一步觀察肌肉與神經組織的疼痛神經網路。


Reference:

1. Nature (2007) 450:56-62
   Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in thenervous system
2. Nat Rev Neurosci. (2008) 9: 417–422
   A technicolour approach to the connectome
3. Nature Methods (2013) 10: 540-547
   Improved tools for the Brainbow toolbox

Optogenetic Approaches to Uncovering the Thalamocortical Plasticity in Neuropathic Pain

l   光遺傳學(Optogenetics)

史丹佛大學神經科學家Karl Deisseroth將一種自海藻中發現的光敏感離子通道--channelrhodopsin的DNA序列，利用遺傳學的方法(例如以病毒感染，或是利用cre-loxp recombination system)轉殖進入神經細胞中。表現channelrhodopsin的神經細胞便可以對特定波長的光線產生反應。因此，只要照射光線在神經細胞上，就可以令channelrhodopsin開啟，讓神經細胞活化產生動作電位。

光遺傳學是神經科學上的一個重大突破。這項技術可以克服傳統電刺激不能解決的問題：(1)我們可以用光刺激活化特定的神經細胞，而不會去影響到其他不相關的神經細胞。(2)有別於電刺激需要保留整個神經細胞，光刺激只需要刺激突觸末梢就可以引發動作電位和神經傳導物質釋放。

             不同種類的光敏感離子通道可以受到不同波長的光激發，並且通透

                不同的離子。(Zhang et al.,2009. Nat.Protoc.)

l   利用光遺傳學的方法研究視丘與腦島皮質神經連結的變化

在過去的研究發現，視丘中的mediodorsal thalamic nucleus (MD)、posterior triangular thalamic nucleus (PoT)分別與前端腦島、後端腦島有神經連結，而且此神經迴路可能與神經痛相關。因此我們想利用光遺傳學的方法研究這條視丘-皮質神經迴路在神經痛後是否有所改變。

我們將攜帶有channelrhodopsin DNA序列的病毒(AAV-CaMKIIα-ChR2-EYFP)打入小鼠MD或是PoT中，因此只有在此二處，以及帶有CaMKIIα啟動子的神經細胞才會表現channelrhodopsin，並且以EYFP螢光做辨識。未來將利用patch clamp技術紀錄腦島皮質的神經活性，用光刺激帶有EYFP螢光的視丘神經末端，比較神經痛對神經活性帶來的改變。

Roles of Posterior Insular Cortex in Rat Model of Neuropathic Pain

•  甚麼是神經痛 (Neuropathic Pain)?

神經痛是由於神經受到損傷所造成的長期疼痛。外傷、細菌病毒感染、癌症入侵都有可能發展出神經痛。這種疼痛會持續非常長的一段時間，可能數月、數年甚至是一輩子。神經痛有幾種明顯的症狀：(1)自發性疼痛(spontaneous pain)，沒有受到任何外界刺激，自己會產生疼痛 (2)觸感痛(allodynia)，正常狀況下的觸覺刺激變成了疼痛 (3)疼痛致敏化(hyperalgesia)，對痛刺激更加地敏感

• 後端腦島皮質(posterior insular cortex, PIC)與疼痛的關係

後端腦島皮質在許多研究中都被發現與疼痛表現有關。在人類影像研究中，當接受疼痛刺激時，後端腦島皮質會有活化的情形。另外，在動物型態實驗中，後端腦島皮質與腦中其他疼痛相關腦區有神經連結，例如：前端腦島(RAIC)和導水管週圍灰質(PAG)。
但是，後端腦島皮質在神經痛當中扮演的角色是甚麼，卻很少有人去研究。因此我的研究便是探討後端腦島皮質是否也在神經痛中佔有一席之地。

• 實驗內容

將NMDA打入大鼠的後端腦島皮質，製造神經興奮性毒性(neurotoxicity)並破壞它。比較在神經痛狀況下的大鼠，破壞後端腦島皮質與否是不是會對神經痛的症狀造成改變。
結果發現，後端腦島皮質被破壞的神經痛老鼠，機械性觸感痛(mechanical allodynia)的症狀會有些許的改善。這表示說後端腦島皮質的確參與在神經痛的症狀表現上，而且只特別針對機械性觸感痛。我們也由此推測，不同神經痛的症狀可能是由不同的大腦區域處理、表現的。

• 參考資料

Benison, A. M., Chumachenko, S., Harrison, J. A., Maier, S. F., Falci, S. P., Watkins, L. R., & Barth,   D. S. (2011). Caudal granular insular cortex is sufficient and necessary for the long-term    
  maintenance of allodynic behavior in the rat attributable to mononeuropathy. J Neurosci, 31(17),
  6317-6328.

Segerdahl, A. R., Mezue, M., Okell, T. W., Farrar, J. T., & Tracey, I. (2015). The dorsal posterior      
  insula subserves a fundamental role in human pain. Nat Neurosci, 18(4), 499-500.

Pain-associated nerve terminal in the gastrocnemius muscle 腓腸肌中痛覺相關神經纖維末梢之研究

• 在本研究，我們利用老鼠腓腸肌作為目標物，來探討其中痛覺相關神經纖維末梢在周邊組織中的分布情形，作為一個基本的實驗前研究。

• 我們採用免疫螢光染色的方式，利用抗體與抗原間專一的結合反應，並透過接上不同的螢光蛋白，來觀察目標物在特定組織中分布的情形。
  而在本研究中，我們利用不同的抗體，例如像TRPV1 (痛覺相關陽離子通道)、Neurofilament 200 (NF-200，標定尺寸中或大的神經元)，以及Peripherin (標定尺寸小或中的神經元)來當作marker，進一步來探討痛覺相關神經纖維末梢在腓腸肌中的分布情形。

• 而在未來的工作裡，我們將進一步配合 clarity (組織透明化) 以及 brainbow (利用腺病毒來感染細胞使其表現特殊的基因片段，讓細胞帶有不同的顏色)，來進一步探討組織間的型態變化以及是否會因慢性肌肉痛而有所影響。

行為電生理研究室

實驗室主持人	嚴震東
實驗室明名稱	行為電生理研究室
近年研究主題
老鼠前腦如何處理痛覺訊息 急性疼痛如何轉變為慢性疼痛 慢性疼痛的治療機制 疼痛同理心"感同身受"的神經機制
研究室簡介
本實驗室研究主題是疼痛的腦機制。我們希望了解疼痛強度及不舒服的訊息在腦中處理的神經網路。並且了解這些神經網路在慢性疼痛時的功能變化。 本實驗室正在進行的研究主題有： (1)  慢性神經痛的腦部活性變化(林校群、黃郁昕、趙子豪、葉瀚元) (2)  慢性神經痛的藥物及電刺激治療的生物機制(林校群、黃郁昕、趙婉婷) (3)  慢性肌肉痛的電刺激治療的生物機制(李志昌、林校群、龔穎之) (4)  癌症骨轉移引起的疼痛及止痛藥作用的生物機制(朱玟樺、林文瑛) (5)  疼痛同理心相關的大腦皮層操作機制(吳玟誼) 本實驗室準備進行的研究主題有： (1)  結合神經遺傳標定及CLARITY透明方法觀察肌肉及神經組織的疼痛神經網路(李志昌、紀瀚雄) (2)  結合腦功能影像方法(calcium imaging, 功能性MRI)，光遺傳及電生理等方法研究疼痛引起的長期腦部變化(趙子豪、葉瀚元、趙婉婷)

DBS-fMRI

MEMRI study of neuropathic pain

周邊神經受損後，其鄰近神經所支配的完好區域經常會變得對疼痛敏感化，發展成慢性神經痛。由於我們對慢性神經痛的病理機轉所知甚少，故患者的疼痛經常未能得到良好的舒緩，生活品質因此受到嚴重引響。過去的研究指出，周邊神經受損時會使自身以及鄰近神經產生異位性放電(Tseng, et al., 2012)，並造成初級感覺神經與脊神經之間的連結增強。我們猜測這樣的周邊異位性放電不只影響了脊神經，亦可能持續性的活化大腦中的某些迴路，使大腦產生可塑性變化而改變了對感覺訊息的處理，進而誘發慢性神經痛。

在本研究中，我們利用錳離子增益性磁振造影(Manganese-Enhanced MRI, MEMRI)追蹤大腦在一定時間區間內所累積的活動。錳離子會影響周遭氫離子的磁振性質，致使錳離子濃度高的區域在MRI影像中訊號增強。由於錳離子的物理性質與鈣離子相近，可經由神經活化時所開啟的鈣離子孔道進入並累積於神經細胞中，故可用來追蹤大腦活動。

在實驗組中，我們在SD品系大鼠施行Sural Nerve Injury (SNI)作為慢性神經痛的模型，將大鼠坐骨神經分支中的腓總神經(common peroneal nerve)以及脛神經(tibal nerve)分支截斷，致使腓腸神經(sural nerve)所支配的腳掌外側產生疼痛敏感化。而對照組的手術中，我們僅暴露出坐骨神經分支後便將傷口縫合。在手術後，我們立即從尾靜脈給予氯化錳溶液(75 mg/kg)，並於24小時候進行MEMRI掃描。

我們比較實驗組語對照組的影像後發現，SNI後的老鼠在最初24小時中，相較於對照組的老鼠在雙側的後端腦島皮質有活動上升的情形。後端腦島皮質在許多研究中都被發現與疼痛表現有關(Benison, et al., 2011)，在SNI後活動增加的後端腦島皮質是否與慢性神經痛的誘發相關則有待更進一步的研究。

參考資料：

Tseng, W.-T., Tsai M.-L., Iwata K. & Yen C.-T. (2012). "Long-term changes in trigeminal ganglionic and thalamic neuronal activities following inferior alveolar nerve transection in behaving rats." The Journal of Neuroscience 32(45): 16051-16063.

Benison, A. M., Chumachenko, S., Harrison, J. A., Maier, S. F., Falci, S. P., Watkins, L. R., & Barth, D. S. (2011). "Caudal granular insular cortex is sufficient and necessary for the long-term maintenance of allodynic behavior in the rat attributable to mononeuropathy." The Journal of Neuroscience 31(17): 6317-6328.

癌細胞誘導骨疼痛

l  癌症骨轉移引起的疼痛 (cancer-induced bone pain, CIBP)

癌症所引起的骨頭痛是臨床上常見的問題，肝癌、前列腺癌是最常發生癌細胞骨轉移的癌症之一。癌細胞轉移到骨頭會破壞生物體內骨骼系統的平衡，產生不斷溶骨或成骨的現象，並造成病患持續性且難以忍受的疼痛，甚至產生骨折、脊髓壓迫、高鈣血症等症狀。目前臨床上常用於癌症疼痛的止痛藥物為鴉片類藥物，例如嗎啡。

l  正子暨電腦斷層掃描 (PET/CT scanning)

正子暨電腦斷層掃描結合了正子掃描(PET)以及電腦斷層掃描(CT)，正子掃描是將帶有放射性同位素標定的追蹤劑注入人體內，以追蹤代謝異常的細胞位置，經常用於癌症檢查。電腦斷層掃描則可以得到解剖影像，將PET/CT兩者影像重疊即可得到PET訊號所在的位置。

正子掃描是藉由放射性同位素產生正電子β衰變的特性偵測訊號，放射性同位素產生正電子β衰變後會釋放出一個正電子，正電子會和生物體中的一個電子相遇後消滅，產生一對呈180度相反方向的Gamma射線。當它們遇到掃描儀中的偵測器時，會造成一點光而被機器探測到，當一對光子同時抵達偵測器被探測到才會被認為是實際的訊號。

l  實驗設計

我們將4T1乳腺癌細胞注入小鼠的大腿骨(股骨)的骨髓腔內，作為乳癌細胞誘發骨疼痛動物模式。透過自發性疼痛行為觀察、機械性觸感痛 (mechanical allodynia)、冷觸感痛 (cold allodynia) 行為測試實驗來確認小鼠癌細胞誘導的骨疼痛症狀與嗎啡止痛效果。並利用[¹⁸F]-FDG PET/CT掃描造影，探討CIBP小鼠自發性疼痛時以及給予嗎啡止痛時的腦部各個區域的葡萄糖代謝變化。

l  參考資料

A. Delaney, S. M. Fleetwood-Walker, L. A. Colvin, and M. Fallon. (2008) Translational medicine: cancer pain mechanisms and management. Br J Anaesth, 101(1):87-94.

H. Young, R. Baum, U. Cremerius, K. Herholz, O. Hoekstra, A. A. Lammertsma, J. Pruim, and P. Price. (1999). Measurement of clinical and subclinical tumour response using [18F]-fluorodeoxyglucose and positron emission tomography: review and 1999 EORTC recommendations. European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) PET Study Group. Eur J Cancer, 35(13):1773-1782.