行為電生理研究室

實驗室主持人	嚴震東
實驗室明名稱	行為電生理研究室
近年研究主題
老鼠前腦如何處理痛覺訊息 急性疼痛如何轉變為慢性疼痛 慢性疼痛的治療機制 疼痛同理心"感同身受"的神經機制
研究室簡介
本實驗室研究主題是疼痛的腦機制。我們希望了解疼痛強度及不舒服的訊息在腦中處理的神經網路。並且了解這些神經網路在慢性疼痛時的功能變化。 本實驗室正在進行的研究主題有： (1)  慢性神經痛的腦部活性變化(林校群、黃郁昕、趙子豪、葉瀚元) (2)  慢性神經痛的藥物及電刺激治療的生物機制(林校群、黃郁昕、趙婉婷) (3)  慢性肌肉痛的電刺激治療的生物機制(李志昌、林校群、龔穎之) (4)  癌症骨轉移引起的疼痛及止痛藥作用的生物機制(朱玟樺、林文瑛) (5)  疼痛同理心相關的大腦皮層操作機制(吳玟誼) 本實驗室準備進行的研究主題有： (1)  結合神經遺傳標定及CLARITY透明方法觀察肌肉及神經組織的疼痛神經網路(李志昌、紀瀚雄) (2)  結合腦功能影像方法(calcium imaging, 功能性MRI)，光遺傳及電生理等方法研究疼痛引起的長期腦部變化(趙子豪、葉瀚元、趙婉婷)

DBS-fMRI

MEMRI study of neuropathic pain

周邊神經受損後，其鄰近神經所支配的完好區域經常會變得對疼痛敏感化，發展成慢性神經痛。由於我們對慢性神經痛的病理機轉所知甚少，故患者的疼痛經常未能得到良好的舒緩，生活品質因此受到嚴重引響。過去的研究指出，周邊神經受損時會使自身以及鄰近神經產生異位性放電(Tseng, et al., 2012)，並造成初級感覺神經與脊神經之間的連結增強。我們猜測這樣的周邊異位性放電不只影響了脊神經，亦可能持續性的活化大腦中的某些迴路，使大腦產生可塑性變化而改變了對感覺訊息的處理，進而誘發慢性神經痛。

在本研究中，我們利用錳離子增益性磁振造影(Manganese-Enhanced MRI, MEMRI)追蹤大腦在一定時間區間內所累積的活動。錳離子會影響周遭氫離子的磁振性質，致使錳離子濃度高的區域在MRI影像中訊號增強。由於錳離子的物理性質與鈣離子相近，可經由神經活化時所開啟的鈣離子孔道進入並累積於神經細胞中，故可用來追蹤大腦活動。

在實驗組中，我們在SD品系大鼠施行Sural Nerve Injury (SNI)作為慢性神經痛的模型，將大鼠坐骨神經分支中的腓總神經(common peroneal nerve)以及脛神經(tibal nerve)分支截斷，致使腓腸神經(sural nerve)所支配的腳掌外側產生疼痛敏感化。而對照組的手術中，我們僅暴露出坐骨神經分支後便將傷口縫合。在手術後，我們立即從尾靜脈給予氯化錳溶液(75 mg/kg)，並於24小時候進行MEMRI掃描。

我們比較實驗組語對照組的影像後發現，SNI後的老鼠在最初24小時中，相較於對照組的老鼠在雙側的後端腦島皮質有活動上升的情形。後端腦島皮質在許多研究中都被發現與疼痛表現有關(Benison, et al., 2011)，在SNI後活動增加的後端腦島皮質是否與慢性神經痛的誘發相關則有待更進一步的研究。

參考資料：

Tseng, W.-T., Tsai M.-L., Iwata K. & Yen C.-T. (2012). "Long-term changes in trigeminal ganglionic and thalamic neuronal activities following inferior alveolar nerve transection in behaving rats." The Journal of Neuroscience 32(45): 16051-16063.

Benison, A. M., Chumachenko, S., Harrison, J. A., Maier, S. F., Falci, S. P., Watkins, L. R., & Barth, D. S. (2011). "Caudal granular insular cortex is sufficient and necessary for the long-term maintenance of allodynic behavior in the rat attributable to mononeuropathy." The Journal of Neuroscience 31(17): 6317-6328.

癌細胞誘導骨疼痛

l  癌症骨轉移引起的疼痛 (cancer-induced bone pain, CIBP)

癌症所引起的骨頭痛是臨床上常見的問題，肝癌、前列腺癌是最常發生癌細胞骨轉移的癌症之一。癌細胞轉移到骨頭會破壞生物體內骨骼系統的平衡，產生不斷溶骨或成骨的現象，並造成病患持續性且難以忍受的疼痛，甚至產生骨折、脊髓壓迫、高鈣血症等症狀。目前臨床上常用於癌症疼痛的止痛藥物為鴉片類藥物，例如嗎啡。

l  正子暨電腦斷層掃描 (PET/CT scanning)

正子暨電腦斷層掃描結合了正子掃描(PET)以及電腦斷層掃描(CT)，正子掃描是將帶有放射性同位素標定的追蹤劑注入人體內，以追蹤代謝異常的細胞位置，經常用於癌症檢查。電腦斷層掃描則可以得到解剖影像，將PET/CT兩者影像重疊即可得到PET訊號所在的位置。

正子掃描是藉由放射性同位素產生正電子β衰變的特性偵測訊號，放射性同位素產生正電子β衰變後會釋放出一個正電子，正電子會和生物體中的一個電子相遇後消滅，產生一對呈180度相反方向的Gamma射線。當它們遇到掃描儀中的偵測器時，會造成一點光而被機器探測到，當一對光子同時抵達偵測器被探測到才會被認為是實際的訊號。

l  實驗設計

我們將4T1乳腺癌細胞注入小鼠的大腿骨(股骨)的骨髓腔內，作為乳癌細胞誘發骨疼痛動物模式。透過自發性疼痛行為觀察、機械性觸感痛 (mechanical allodynia)、冷觸感痛 (cold allodynia) 行為測試實驗來確認小鼠癌細胞誘導的骨疼痛症狀與嗎啡止痛效果。並利用[¹⁸F]-FDG PET/CT掃描造影，探討CIBP小鼠自發性疼痛時以及給予嗎啡止痛時的腦部各個區域的葡萄糖代謝變化。

l  參考資料

A. Delaney, S. M. Fleetwood-Walker, L. A. Colvin, and M. Fallon. (2008) Translational medicine: cancer pain mechanisms and management. Br J Anaesth, 101(1):87-94.

H. Young, R. Baum, U. Cremerius, K. Herholz, O. Hoekstra, A. A. Lammertsma, J. Pruim, and P. Price. (1999). Measurement of clinical and subclinical tumour response using [18F]-fluorodeoxyglucose and positron emission tomography: review and 1999 EORTC recommendations. European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) PET Study Group. Eur J Cancer, 35(13):1773-1782.

神經痛的大腦功能性變化

神經痛是指體感覺系統因疾病或受傷造成的疼痛，與一般發炎導致的疼痛不同，服用NSAIDs類止痛藥(如市售的伊普芬)並無法止痛。周邊的疼痛訊息由dorsal root ganglion細胞傳遞給spinal dorsal horn細胞，再往上傳遞到大腦，而疼痛這種感覺只在大腦裡形成。現代的腦部功能性影像系統，可以讓我們進一步了解在神經痛時，大腦產生了什麼變化。我們使用正子造影，搭配作為追蹤劑的放射性葡萄糖，比較大鼠在神經痛時腦部有什麼變化，以及注射臨床使用的止痛藥gabapentin (GBP)，這些與疼痛有關的區域有什麼改變。首先我們將大鼠的坐骨神經局部結紮，產生明顯的神經痛症狀。接著以不同的實驗設計，掃描大鼠的腦部葡萄糖代謝率。可知神經痛會使腦部的島狀皮質、丘腦及小腦代謝率增加，而給予GBP後，丘腦及小腦代謝率回到基準值，而前額葉皮質的代謝率特別下降。正子造影提供我們一個整體的疼痛腦部變化地圖，未來我們可以根據這些改變的區域進一步研究神經痛的機制。

參考資料：
Lin HC, Huang YH, Chao TH, Lin WY, Sun WZ, Yen CT. 2014. Gabapentin reverses central hypersensitivity and suppresses medial prefrontal cortical glucose metabolism in rats with neuropathic pain. Mol Pain 10: 63.

CLARITY 組織透明化技術

l  什麼是CLARITY

CLARITY 組織透明化技術，保留完整的組織結構、細胞形態以及重要的訊息分子，例如蛋白質、核酸等，讓組織變成透明。透過這樣的處理，我們有機會在大範圍的組織中，進行細微結構的探索，重要的是跳過傳統組織技術切片的過程，組織的完整可以更忠實的呈現。

l  為什麼不透明？

光線經過不同的介質，因為折係數的差異，會改變光線行進的方向，水杯中的筷子產生轉折的影像就是一個例子。生物細胞有富含脂肪分子的細胞膜包覆，胞內、胞外有著成分不同的液體分布，光線穿入組織時，就不斷的在這些不同的介質間轉折，於是無法穿過，所以不透明。把脂肪分子移除，可以有效改變光線的折射，讓組織變成透明。

l    如何透明？

CLARITY 主要的處理流程有三個步驟：

1.      組織用混和 arymlamine 和 paraformaldehyde 的hydrogel 固定，將溫度由4C 提升到37C 的過程聚合，形成網狀結構，將組織固定

2.      組織放在循環的SDS 容易中，利用電泳形成的驅力，讓 SDS穿透過組織，將脂肪分子帶走

3.      最後將 SDS洗清後，可以用免疫組織化學的方式，將我們有興趣的分子，標定螢光訊號。若是樣本本身就帶有內生的螢光訊號，則讓整個組織標本呈現的資訊內容更為豐富。經過特定澄清液（FocusClear, RapiClear …）的調整，組織可以達到最佳程度的透明。可以肉眼直視，一目了然。

l   在 Confocol microscope 的系統中，我們可以大範圍掃描擷取3D 結構中的細節，從不同的角度或不同深度觀察。展示的相片拍攝位置：中樞的大腦皮層（圖A）、海馬迴（圖B）、周邊的背根神經節（圖C）、舌頭中的肌肉與血管（圖D）、大腦皮層中的錐狀細胞（圖E）、齒狀回（圖F）。